新鲜胚胎是怎么保存的，鲜胚在体内可存活多久

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胚胎是如何保存的大家知道吗

三步平衡法

（1）10%甘油保存液的配制

取9毫升20%羊血清的PBS，加入1毫升甘油，用吸管反复混合15～20次，经0.22微米滤器过滤到灭菌器内待用。

（2）取含20%羊血清0.3摩尔蔗糖的PBS 2毫升和3.5毫升，分别加入10%甘油3毫升和1.5毫升，配成含6%和3%甘油的蔗糖冷冻液。将3%、6%和10%三种甘油浓度的冷冻液分别装入小培养皿。

（3）胚胎分别在3%、6%和10%甘油的冷冻液中浸5分钟。

（4）胚胎装管

用0.25毫升塑料细管按以下顺序吸入，少量的10%甘油的PBS液、气泡、10%甘油的PBS液（含有胚胎）、气泡、少量的10%甘油的PBS液，加热封口两道（图9-18）。

图9-18胚胎装管示意图

（5）塑料细管的编号

剪一段（2厘米）0.5毫升塑料细管作为标记外套，内装色纸，注明供体品种、耳号、胚胎发育阶段及等级、制作日期（年、月、日），并在外套管上写明序号备查。

（6）冷冻程序

将细管直接浸入冷冻仪的酒精浴槽内，以1℃/分钟的速度从室温降至-6℃，停5分钟后植冰，再停留10分钟，以0.3℃/分钟的速度降至-36℃，再以0.1℃/分钟的速度降至-38℃，直接投入液氮，长期保存。

（7）冷冻胚胎的解冻

①解冻液的配制根据上文所述配制出10%、6%和3%甘油的蔗糖解冻液，用0.22微米过滤器灭菌，分装在小培养皿内，第1～4杯分别为10%、6%、3%、0%甘油的蔗糖解冻液，第5杯为PBS保存液。

②胚胎的解冻胚胎从液氮中取出，在3秒钟内投入38℃水浴，浸10秒钟。

③三步脱甘油用70%酒精棉球擦拭塑料细管和剪刀刃，剪去棉塞端，与带有空气的1毫升注射器连接。再剪去细管的另一端，在室温下将胚胎推入10%甘油和0.3摩尔蔗糖的PBS解冻液中，放置5分钟后依次移入6%、3%和0%甘油的蔗糖PBS解冻液中，各停留5分钟，最后移至PBS保存液中镜检待用。

胚胎冷冻保存的方法有哪些他们的异同点是什么

在丁香园（ http://dxy.ac.cn）找到：

关键词：胚胎冷冻；转基因小鼠；胚胎移植

随着生物工程技术的发展．出现了许多生物工程小鼠品系．促使胚胎冷冻技术得到了广泛应用。胚胎冷冻技术不仅为转基因动物提供可用胚胎．还使胚胎移植不受时间、地域限制。简化引种过程．防止疾病传播。为建立优良动物的胚胎库提供了条件。综述了几种常用的胚胎冷冻方法及其在转基因小鼠中的应用研究．指出了胚胎冷冻方法存在的主要问题，并展望了其发展

20080501003.GIF(3.65 KB)

2008-5-1 21:41

胚胎冷冻技术是一种简单、实用、经济而可靠的保种方法，它能降低动物饲养和繁育成本，扩大动物品系的保存能力，也可随时为其它胚胎工程技术如胚胎移植、胚胎分割、体外受精、动物性别控制、转基因动物技术和胚胎干细胞技术等提供可用胚胎。通过建立胚胎库，可以在世界范围内运送胚胎，从而取代活体运输，既降低了费用又可避免疾病的传播，还能解决遗传漂变以及人为、环境因素造成的动物生物学特征和遗传特性的改变等问题。

1胚胎冷冻技术

胚胎冷冻技术是对体内或体外受精所得到的可供移植的胚胎进行冷冻，并根据需要解冻后供移植的一种生物技术。胚胎冷冻技术的发展经历了由繁到简的过程，主要围绕程序简化、缩短冻存时间、选择低温保护剂及冷冻方法、解冻方法等方面进行研究，所选方法和程序的目的都是尽可能减少胚胎在冷冻时的物理损伤，提高胚胎冷冻／解冻后的存活率和移植妊娠率，并产下健康的后代。

1．1冷冻方法

(1)程序冷冻法

程序冷冻法主要使用渗透较慢的低温保护剂，如乙二醇(EG)、丙二醇(PG)、甘油(G)、二甲基亚砜(DMSO)，使冷冻保护剂充分渗透人胚胎细胞内，平衡后，利用程序降温仪缓慢降温，最后投入液氮保存。1972年，Whittingham等首次报导了小鼠胚胎在-196℃和-269℃冷冻保存获得成功，引起了科学界的广泛重视。随后相继应用这种方法在牛、兔、绵羊、大鼠、山羊和马等多种哺乳动物上获得成功。

程序冷冻法采用较低浓度的冷冻保护剂，对胚胎毒性损害小，解冻后存活率较高。但因其操作繁琐，降温速度慢，致使所需时间长，需要特殊的降温装置，在不具备实验条件的场所不能使用此法进行胚胎冷冻。目前国内外均较少使用。

(2)玻璃化冷冻法

玻璃化冷冻法是将胚胎或卵母细胞在适当的冷冻保护剂混合液中做短暂处理后，直接投入液氮。与传统的程序冷冻法相比，玻璃化冷冻法的优点主要在于：细胞和液氮直接接触，冷冻速率明显增加；方法简单，缩短了冷冻程序的时间；免除了昂贵的程序降温仪的费用，在一般的实验室就可进行操作。下面介绍几种常用的玻璃化冷冻法。

①超快速冷冻法

l985年，Rail等首次应用DMSO、乙酰胺、丙二醇、聚乙二醇组成的玻璃化溶液超快速冷冻小鼠胚胎获得成功。1986年，Scheffen等以25%甘油和25% 1，2一丙二醇玻璃化超快速冷冻牛胚胎，降低了玻璃化溶液的毒性；同年，Kasai等以40%乙二醇、0．5 mol／L蔗糖和30 Ficoll的混合溶液超快速冷冻小鼠胚胎。获得了较高存活率(98%)，进一步降低了玻璃化溶液的毒性；2002年，朱士恩等应用以EG和DMSO为主体的抗冻保护剂玻璃化冷冻小鼠原核胚，移植后妊娠率和产仔率与鲜胚的效果相近。2003年，Fujio等以DAP213(2．0 mol／LDMSO+1．0 mol／l乙酰胺+3．0 mol／L丙二醇)为冷冻保护剂冷冻小鼠获得成功；2005年，Baranyai等分别用SSV(Solid surface vitrification)法和麦管法冷冻小鼠8一细胞期胚胎，证明了SSV法对于桑椹胚和胚泡阶段的胚胎是一种较好的冷冻方法。

②开放式拉长塑料细管法(open pulled straws，OPS)

OPS法是丹麦人Vajta于1997年发明的，他使用薄壁细管，利用毛细现象将微量冷冻液滴和胚胎一起吸人管内后，投入液氮。这种方法克服了传统玻璃化的缺点，加快了冷冻速度和复苏速度，其降温速率可达2 500℃／min，且对细胞的毒性和损伤作用较小。1998年，Vajta等应用OPS法冷冻牛不同阶段的胚胎，结果表明，受精后3～7 d的胚胎复苏后囊胚形成率为60～95%，和新鲜胚胎无显著差别，且牛卵母细胞复苏后囊胚形成率高达25%，移植后产生3个仔牛。Lazar等应用OPS玻璃化法冷冻了117个牛囊胎，复苏后孵化率为39．5%，移植率和妊娠率分别为16．7%和50%，均显著高于普通麦管玻璃化冷冻。朱亮等应用OPS法和传统麦管法对小鼠扩张囊胚进行玻璃化冷冻，结果表明，应用OPS法冷冻小鼠囊胚存活率(82．3%)显著高于应用传统麦管者(68．6％)，且前者的冷冻囊胚孵出率(70．3%)也明显高于后者(57．1%)，因此认为OPS法是一种行之有效的冷冻方法。但是OPS法也存在一些不足，由于冷冻液与液氮直接接触，液氮里的一些潜在的污染源会增加污染的机会。

③封闭式拉长塑料细管法(closed pulled straws，CPS)

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有图，拷不下，可能有新回复：http://dxy.ac.cn/wiki/thread-664-1-1.html

胚胎如何冷冻保存

三步平衡法

（1）10%甘油保存液的配制

取9毫升20%羊血清的PBS，加入1毫升甘油，用吸管反复混合15～20次，经0.22微米滤器过滤到灭菌器内待用。

（2）取含20%羊血清0.3摩尔蔗糖的PBS 2毫升和3.5毫升，分别加入10%甘油3毫升和1.5毫升，配成含6%和3%甘油的蔗糖冷冻液。将3%、6%和10%三种甘油浓度的冷冻液分别装入小培养皿。

（3）胚胎分别在3%、6%和10%甘油的冷冻液中浸5分钟。

（4）胚胎装管

用0.25毫升塑料细管按以下顺序吸入，少量的10%甘油的PBS液、气泡、10%甘油的PBS液（含有胚胎）、气泡、少量的10%甘油的PBS液，加热封口两道（图9-18）。

图9-18胚胎装管示意图

（5）塑料细管的编号

剪一段（2厘米）0.5毫升塑料细管作为标记外套，内装色纸，注明供体品种、耳号、胚胎发育阶段及等级、制作日期（年、月、日），并在外套管上写明序号备查。

（6）冷冻程序

将细管直接浸入冷冻仪的酒精浴槽内，以1℃/分钟的速度从室温降至-6℃，停5分钟后植冰，再停留10分钟，以0.3℃/分钟的速度降至-36℃，再以0.1℃/分钟的速度降至-38℃，直接投入液氮，长期保存。

（7）冷冻胚胎的解冻

①解冻液的配制根据上文所述配制出10%、6%和3%甘油的蔗糖解冻液，用0.22微米过滤器灭菌，分装在小培养皿内，第1～4杯分别为10%、6%、3%、0%甘油的蔗糖解冻液，第5杯为PBS保存液。

②胚胎的解冻胚胎从液氮中取出，在3秒钟内投入38℃水浴，浸10秒钟。

③三步脱甘油用70%酒精棉球擦拭塑料细管和剪刀刃，剪去棉塞端，与带有空气的1毫升注射器连接。再剪去细管的另一端，在室温下将胚胎推入10%甘油和0.3摩尔蔗糖的PBS解冻液中，放置5分钟后依次移入6%、3%和0%甘油的蔗糖PBS解冻液中，各停留5分钟，最后移至PBS保存液中镜检待用。

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