胚胎透明带厚做孵化？早期胚胎辅助孵化是什么意思

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为什么胚胎外壳厚

辅助孵化是在体外受精（IVF）周期，其中一个孔被机械地或化学地制成在壳胚胎的胚被转移回子宫之前。这样做的希望是增加胚胎附着在子宫上的机会（植入）并实现怀孕或使滋养外胚层细胞可用于胚胎活检。

为什么要进行辅助孵化

为什么要进行辅助孵化？一切源于一个胚胎的”壳“说起。

每个卵子周围都有一个天然壳，它有两个作用：

第一种是只让一个精子进入，确保胚胎中没有太多的染色体。

第二项工作是保护分裂中的胚胎的细胞，并确保不会在无法进行妊娠的输卵管（而不是子宫）中过早植入。

这种壳被称为透明带，它是由蛋白质组成的薄而胶状的层，您可以看到每个卵子和胚胎在显微镜下看到的光环。

这是一张受精卵的照片。您会看到胚胎周围的壳仍然是单个细胞。

一旦胚胎发育到胚泡（囊胚）期，它就必须从壳中逸出以便能够植入子宫。

如果胚胎的壳比平常更厚或更硬，则胚泡可能很难自然孵化，不能孵化的后果是——胚胎细胞无法与子宫内膜接触，这意味着植入失败并且不会怀孕。

而辅助孵化就是解决这个难题的，胚胎在实验室中孵化后，转移后就不可能将其困在壳内。

辅助孵化是什么样的？

辅助孵化可以通过多种方式完成。最常见的方法是使用附在显微镜上的激光。这使胚胎学家可以使用短激光脉冲在外壳上打一个小孔。

其他方法是通过部分透明带解剖或用微型工具和酸酪醇将壳切开，后者是一种溶解掉壳部分的化学物质。这些方法都很容易在贝壳上打孔，熟练的胚胎学家容易做到。

在这里，您可以看到一个囊胚，该囊胚已协助孵化，而一小部分外壳缺失。

下面照片中的胚胎都从壳中孵化出来，可以植入了

孵化小鸡技术

一、在孵化之前要选择种蛋，在一周以内的蛋为好，最好是3-4天内的。温度控制在37.1～37.2℃，湿度控制在70～80%。

二、落盘时用手工将种蛋从孵化蛋盘移到出雏盘内，操作中室温要保持25℃左右,动作要快,在30～40分钟内完成每台孵化机的蛋,时间太长不利胚胎发育。

三、鸡孵化到20.5天大批破壳出雏,整批孵化的只要捡2次雏即可清盘；分批入孵种蛋的,由于出雏不齐则每隔4～6小时捡一次。操作时应将脐带吸收不好、绒毛不干的雏鸡应暂留出雏机内。提高出雏机的温度0.5～1℃,鸡到21.5天后再出雏作为弱雏处理。

四、鸡苗出壳24小时内做马立克疫苗免疫并在最短时间内将雏鸡运到育雏舍。

1.自然孵化，有母鸡孵蛋，可以省却人工，并且提供适宜的温度和湿度，但是不适合大规模孵化鸡蛋。

2.适宜的温度和湿度控制可直接影响到鸡蛋的孵化率。因此选择恰当的孵化技术，通过人工控制孵化环境可以提高种蛋的孵化率。

辅助孵化的原理机理

一、辅助孵化的由来及依据

最早提出辅助孵化概念的是．jacquescohen。他认为：在ivf—et过程中，胚胎不能从透明带中孵化出来，是造成胚胎植入失败高的原因之一。如果对体外受精的胚胎进行辅助孵化(即人为地在透明带上开口，或使其变薄)，将有助于提高胚胎的植入率。

他们的依据是：

①无论是人或者老鼠的胚胎经过辅助孵化的显微手术后，胚胎开始孵化的时间和孵化的形态学特征都会发生改变，说明辅助孵化的显微手术对胚胎的孵化过程确实可造成影响；

②人为地在透明带上开口之后，胚胎的植入率提高。可能是因为辅助孵化增加了胚胎吻合子宫内膜植入窗口开放的机会；

③透明带较薄的胚胎易于植入；

④任何影响孵化的因素都会导致胚胎孵化过程的延误和缺失，致使植入失败。

1991年cohen的实验室使用酸化的方法对人类体外培养胚胎成功地进行了辅助孵化。经过辅助孵化之后的胚胎，其植入率虽然有所改善，但与对照组相比，并无统计学上的差异。进一步的观察和分析表明：辅助孵化并不是对所有的病人和所有的胚胎都有提高植入率的作用，而仅是对于那些因某种原因导致自身孵化困难的胚胎有帮助，如透明带过厚的胚胎，透明带异常的胚胎，母体年龄偏大的病人，和fsh水平过高的病人等。由此，产生了选择性辅助孵化的概念。即根据母体以及每个胚胎自身的具体情况，选择自身孵化困难的胚胎，给予辅助性孵化。辅助性孵化有助于提高胚胎的植入率，可能是与帮助透明带厚度和硬度异常的胚胎突破机械性屏障，以及帮助质量差而无足够能量完成自身孵化的胚胎突破透明带有关。

二、辅助孵化的特征由于辅助孵化并不是对每一个胚胎都有提高植入的作用，为了避免使胚胎暴露于不必要的操作程序和刺激，(iohen根据他的实验室的观察结果，提出了进行辅助孵化的指征。在以后的ivf实践中，其他的ivf中心又对这些指征进行了不断的扩增和补充。虽然不同的ivf中心对指征的掌握有所不同，但总的说来，在决定某个胚胎是否需要进行辅助孵化时，通常考虑的因素包括：母体的年龄、fsh水平、ivf治疗史、胚胎自身质量、胚胎自身发育速度、透明带的厚度、均匀度以及形状。

1．透明带

(1)透明带的厚度：透明带的厚度大于13um的胚胎应予辅助性孵化；

(2)透明带的形状：当胚胎的形状不规则时，如椭圆形，常常提示透明带有某种功能上的缺陷。因此，胚胎形状不规则，通常是需要辅助孵化的指征；

(3)透明带的颜色：透明带的颜色偏深，如呈现偏棕色或偏深色，应予以辅助性孵化。

2．母体年龄

母体的年龄是考虑是否需要给予辅助性孵化的一个重要因素。随着母体年龄的增大，其胚胎的透明带通常会变厚变硬，失去弹性，造成胚胎自然孵化困难。同时，来自母体年龄较大的胚胎，其质量通常较差，也会给胚胎的自然孵化带来困难。有的ivf中心以母体年龄38岁为界，凡母体年龄38岁或大于38岁，其所有用于et的胚胎都应给予辅助l生孵化。而有的ivf中心是以母体年龄40岁为界。

3．胚胎的质量

对于质量较差，含有较多碎片的胚胎，其植入的能力通常较差。进行辅助性孵化之后，其植入能力也许有所提高。

4．胚胎的发育速度

发育速度迟缓的胚胎，其自然孵化能力常常减弱，孵化过程常常延迟。辅助性孵化之后，有助于胚胎保持与子宫内膜植入窗口开放时间的一致性。受精后第3d细胞数目仍少于6个的胚胎，经过辅助性孵化后，其植入率高于未经辅助性孵化的对照组。

5．ivf治疗史

对于曾有过失败的ivf治疗史的病人，应给予辅助性孵化治疗。因为，自然孵化失败很可能是导致他们ivf治疗失败的原因之一。

6．fsh水平

如果在周期的第3d，fsh水平过高(大于15miu/ml)，通常提示卵巢的功能状况较差。这类病人的透明带很可能会因为卵泡发育环境不良而结构异常或功能较差。辅助性孵化常常会提高这类胚胎的植入率。

7．冷冻胚胎

经过冷冻和解冻之后，胚胎的透明带会变硬。因此，冷冻胚胎是辅助性孵化的指征之一。

三、辅助孵化的方法及其操作目前有4种辅助孵化的方法：机械法、酸化法、激光法和酶消化法。其中酸化法和机械法在临床七．应用广泛，尤其是酸化法；激光法因为需要特殊的设备，在临床上较少使用；酶消化法是近年来出现的一种新方法。据报道，酶消化法对囊胚的植入有明显的帮助，此方法的效果尚待更多的临床实践予以证实。

(一)机械法

机械法在英文中称为pairtialzonadissection，简称pzd。

1．辅助孵化工作盘的制作

(1)用含有6%plasmanate(商品化的人类血浆蛋白制剂)的htf或pbs在falcon1006盘中做小滴。根据待辅助孵化的胚胎数目决定小滴的数目。每个小滴的体积中l0入；

(2)在小滴上面覆盖约4ml左右的经过处理的矿物油(minel·aloil)；

(3)盖好盘盖后，将工作盘放人37℃培养箱预热待用，一般需在使用前30min进行预热；

2．显微操作台的准备

将固定针安装在左手边的显微注射针支架上，将pzi)针安装在右手边的显微注射针支架上。

3．机械法辅助孵化的操作

(1)将待辅助孵化的胚胎放人工作盘的小滴中，每滴中放1个，一次以放2个胚胎为宜，以免操作时间长，使胚胎过久地暴露于非培养环境中。

(2)将固定针降入小滴，让卵黄间隙较大的区域处于11点至l点处，在9点钟处用固定针将胚胎固定。

(3)将pz[)针降入小滴，从胚胎的1点钟左右的部位进针，从1l点左右的部位穿出。操作时严格避免伤及胚胎的细胞。

(4)将固定胚胎的固定针放松，从9点钟处移至：pzi)针之上，用其反复磨擦pz[]针．盲至透明带被穿透，pzd针脱出透明带，裂隙形成为止。

(5)将胚胎旋转90度’，重复上述操作2次。最终在透明带上形成两条十字交叉的裂隙。

4．将经过辅助孵化的胚胎在干净的培养液中清洗3次，然后放回原培养盘的小滴中或者et盘中，等待et

(二)酸化法

酸化法是指使用Acid Tyde's Solution(简称AT Solution)溶解透明带，在透明带上形成一个直径约大于20gim的小洞。

1．辅助孵化工作盘的制作

(1)用at溶液在falcon1006盘的上方做一个10九的小滴，用红色记号笔在盘子底部将其圈起来，以示区别。

(2)用含有6%plasmanate．的htf或pbs在该盘的下部中做体积为10的小滴。小滴的数目等于待辅助孵化的胚胎的数目。

(3)在小滴上覆盖4ml左右的经过处理的矿物油。

(4)盖好盘盖后，将工作盘放入37℃培养箱预热待用，一般需在使用前30min进行预热；

2．显微操作台的准备

(1)将固定针安装在左手边的显微注射针支架上。

(2)将固定针安装在右手边的显微注射针支架上，并与嘴吸控制装置(moul：h—eontrolledsuc!ion)相连接。

3．酸化辅助孵化的操作

(1)在透明带上打洞

1)将固定针降人at小滴中，用嘴吸控制装置将at溶液吸入holdingpipette-，然后将固定针提出液面。

2)用固定针在胚胎的9点钟处将其固定，并使卵黄间隙较大的区域或者碎片较多的区域处于3点钟处。

3)将固定针置于胚胎的3点钟处，使用嘴吸控制装置小心地将at溶液吹在透明带上，使其溶解，固定针在吹入at溶液的同时，应做轻微的上下移动，使接触at溶液的透明带的范围约200um。

4)一旦透明带被溶解穿透，立即停止吹at溶液并迅速小心地开始回吸，以对该区域的at溶液进行清除。

5)继续用固定针固定胚胎，同时移动显微镜的载物台，使胚胎离开刚才的工作区域，减少酸与胚胎的接触。

(2)取出碎片对于含有碎片的胚胎，可利用刚刚在透明带上溶解出来的小洞，使用固定针将碎片吸出。进行此项操作时，严防伤害胚胎细胞或将胚胎细胞误吸出来。

4．酸化后胚胎的清洗将经过酸化法辅助孵化的胚胎在干净的培养液中清洗3次后，放回原培养盘的小滴中或者et盘中，等待et。

(三)酶消化法

近年来，有的ivf中心为了避免酸溶液对胚胎造成的可能性伤害，用pronast代替at溶液在局部溶解透明带，以达到辅助孵化的目的。随着囊胚植人受到越来越多的重视，有的中心采用在植入前将囊胚放入一定浓度的pr)nas溶液中培养24h，使得透明带完全被酶消化而消失，以促进囊胚的植入。

(四)激光法

激光法是指采用激光光束在透明带上打洞，以起到辅助孵化的作用。

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