胚胎显微操作仪，显微注射仪的用途

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胚胎的胚胎工程

胚胎工程是指对动物早期胚胎或配子所进行的多种显微操作和处理技术，如胚胎移植、体外受精、胚胎分割、胚胎干细胞培养等技术。经过处理后获得的胚胎，还需移植到雌性动物体内生产后代，以满足人类的各种需求。

动物胚胎发育的基本过程

1．受精场所是母体的输卵管。

2．卵裂期：特点：细胞有丝分裂，细胞数量不断增加，但胚胎的总体体积并不增加，或略有减小。

3．桑椹胚：特点：胚胎细胞数目达到32个左右时，胚胎形成致密的细胞团，形似桑椹。是全能细胞。

4．囊胚：特点：细胞开始出现分化（该时期细胞的全能性仍比较高）。聚集在胚胎一端个体较大的细胞称为内细胞团，将来发育成胎儿的各种组织。中间的空腔称为囊胚腔。

5．原肠胚：特点：有了三胚层的分化，具有囊胚腔和原肠腔。

胚胎工程的应用

1．体外受精和胚胎的早期培养

(1)卵母细胞的采集和培养：主要方法：用促性腺激素处理，使其排出更多的卵子，然后，从输卵管中冲取卵子，直接与获能的精子在体外受精。第二种方法：从刚屠宰母畜的卵巢中采集卵母细胞；第三种方法是借助超声波探测仪、腹腔镜等直接从活体动物的卵巢中吸取卵母细胞。采集的卵母细胞，都要在体外经人工培养成熟后，才能与获能的精子受精。

(2)精子的采集和获能：在体外受精前，要对精子进行获能处理。

(3)受精：获能的精子和培养成熟的卵细胞在获能溶液或专用的受精溶液中完成受精过程。

(4)胚胎的早期培养：精子与卵子在体外受精后，应将受精卵移入发育培养液中继续培养，以检查受精状况和受精卵的发育能力。培养液成分较复杂，除一些无机盐和有机盐外，还需添加维生素、激素、氨基酸、核苷酸等营养成分，以及血清等物质。当胚胎发育到适宜的阶段时，可将其取出向受体移植或冷冻保存。不同动物胚胎移植的时间不同。(牛、羊一般要培育到桑椹胚或囊胚阶段才能进行移植，小鼠、家兔等实验动物可在更早的阶段移植，人的体外受精胚胎可在4个细胞阶段移植。)

2．胚胎移植

(1)胚胎移植是指将雌性动物的早期胚胎，或者通过体外受精及其它方式得到的胚胎，移植到同种的、生理状态相同的其它雌性动物的体内，使之继续发育为新个体的技术。其中提供胚胎的个体称为“供体”，接受胚胎的个体称为“受体”。（供体为优良品种，作为受体的雌性动物应为常见或存量大的品种。）

地位：如转基因、核移植，或体外受精等任何一项胚胎工程技术所生产的胚胎，都必须经过胚胎移植技术才能获得后代，是胚胎工程的最后一道“工序”。

(2)胚胎移植的意义：大大缩短了供体本身的繁殖周期，充分发挥雌性优良个体的繁殖能力。

(3)生理学基础：①动物发情排卵后，同种动物的供、受体生殖器官的生理变化是相同的。这就为供体的胚胎移入受体提供了相同的生理环境。

②早期胚胎在一定时间内处于游离状态。这就为胚胎的收集提供了可能。

③受体对移入子宫的外来胚胎不发生免疫排斥反应。这为胚胎在受体的存活提供了可能。

④供体胚胎可与受体子宫建立正常的生理和组织联系，但供体胚胎的遗传特性在孕育过程中不受影响。

(4)基本程序主要包括：

①对供、受体的选择和处理。选择遗传特性和生产性能优秀的供体，有健康的体质和正常繁殖能力的受体，供体和受体是同一物种。并用激素进行同期发情处理，用促性腺激素对供体母牛做超数排卵处理。

②配种或人工授精。

③对胚胎的收集、检查、培养或保存。配种或输精后第7天，用特制的冲卵装置，把供体母牛子宫内的胚胎冲洗出来(也叫冲卵)。对胚胎进行质量检查，此时的胚胎应发育到桑椹或胚囊胚阶段。直接向受体移植或放入－196℃的液氮中保存。

④对胚胎进行移植。

⑤移植后的检查。对受体母牛进行是否妊娠的检查。

3．胚胎分割

(1)概念：是指采用机械方法将早期胚胎切割2等份、4等份等，经移植获得同卵双胎或多胎的技术。

(2)意义：来自同一胚胎的后代具有相同的遗传物质，属于无性繁殖。

(3)材料：发育良好，形态正常的桑椹胚或囊胚。（桑椹胚至囊胚的发育过程中，细胞开始分化，但其全能性仍很高，也可用于胚胎分割。）

(4)操作过程：对囊胚阶段的胚胎分割时，要将内细胞团均等分割，否则会影响分割后胚胎的恢复和进一步发育。

什么是胚胎分割技术

胚胎分割是指采用机械方法将早期胚胎切割成2等份、4等份或8等份等，经移植获得同卵双胎或多胎的技术。胚胎分割需要的主要仪器设备为实体显微镜和显微操作仪。

进行胚胎分割时，应选择发育良好的囊胚，用分割针或分割刀进行分割，对囊胚进行分割时，要注意将内细胞团均等分割，否则会影响胚胎的恢复和进一步发育。

胚胎分割主要用于优良品种的繁殖，以牛为例，有的牛奶多，但繁殖慢。这时，就用促性腺激素促使该良种母牛超数排卵，然后把卵从该母牛体内取出，在试管内与人工采集的精子进行体外受精，培育成胚胎，再把胚胎送入经过同期激素处理、可以接受胚胎、孕期相同的母牛子宫内，孕育出小牛。

胚胎分割技术的发展史

胚胎工程

在胚胎发育过程中进行的生物技术，称为胚胎工程技术

包括：胚胎移植、胚胎融合、胚胎分割、胚胎冷冻、胚胎性别鉴定、胚胎细胞核移植、转基因操作等

Aristotle胚胎完全来自雌性，雄性精液的贡献是非物质性

17世纪，英 William Harvey动物完全来自卵子

1673，Malpighi“先成说”来自未受精卵子

6年后，Leeuwenhoek精子发现，“精源说”

1759年，德国Wolff“后成说”

鱼、两栖类、爬行类、鸟类的卵子很大，因此错误的认为哺乳类的卵子也很大，把卵泡错误的认为是卵子，1827年被纠正

19世纪初，首次观察到精子穿入卵子，开始对两性在生命个体发生中的作用有所了解，而精子、卵子体积都非常小，肉眼很难分辨，并且受精是在体内发生，因此研究受到了研制研究简介

1878，德Scnenk尝试哺乳动物卵子体外受精

1890年，Heape，兔

1944年，Rock、Menkin，人

1945年，张明觉，兔体外受精，后5年内没有重复出来

1951年，Chang和 Austin发现精子获能现象，体外受精史上的里程碑

1959年，首例试管兔出生，体外受精技术真正得到承认

1964年，Yanagimachi获得试管仓鼠

1978年，首例试管婴儿出生，体外受精技术走向全面应用的标志性事件，是医学和生物学上的一次伟大革命

l濒危动物的保护

1983年，黑猩猩体外受精，观察到卵裂

1989年，大熊猫精子成功体外获能

1990年，美洲虎和美洲豹，同年获得美洲虎体外受精后代基本技术

体外培养

体外受精与发育

精子、卵子、胚胎冷冻保存体外受精（in vitro fertilization,IVF)

定义在体外环境完成精卵结合的过程

步骤Ø卵母细胞的体外成熟Ø精子的体外获能Ø卵母细胞的体外受精Ø受精卵的体外发育Ø配子和胚胎的冷冻保存卵母细胞的体外成熟

体外成熟-卵母细胞的回收回收方法•抽吸法（常用）•切割法（回收到卵子数目比较多）回收卵子分级• A级,有3层以上致密的卵丘细胞,胞质均匀凝暗• B级,卵丘细胞在3层以下或部分脱落、但胞质均匀• C级,卵丘细胞层很少、松散或全部脱落、胞质无凝块或无颗粒状。• D级，死亡或退化的卵母细胞。• A级和B级卵母细胞可用于体外成熟培养体外成熟-影响因素 l卵母细胞成熟涉及细胞核、细胞质和质膜的成熟变化 l细胞质成熟机制尚不清楚,但肯定涉及细胞质成分的重组和卵质蛋白的合成，为受精和胚胎发育做准备体外成熟-影响因素 l发情周期的阶段和卵泡大小 l卵母细胞成熟培养体系 l激素、血清和生长因子（细胞质的成熟）精子的体外获能 l哺乳动物精子在附睾里成熟,在射出后不是立即就具有与卵母细胞受精的能力,这些精子必须经过一个获能期,这个获能期在自然情况下发生在雌性生殖道里 Austion(1951) l精子在雌性生殖道停留一段时间,发生一系列生理生化变化,才能成功地与卵子结合称为受精,精子能够受精的能力为“获能”( capaciation)顶体反应 l由精卵结合诱发的胞吐作用,是精卵融合的先决条件。它使精子能够进入卵周隙,暴露和修饰精子表面的顶体内膜区域 l精子首先通过顶体反应后暴露出的顶体内膜与卵细胞膜接触,随后,精子的赤道段和头后部区域与卵细胞膜结合和融合 l在人类,顶体反应对于精子附着于卵细胞膜非常重要而且是必须的 l只有发生了顶体反应的精子才能与卵细胞膜融合精子的获能处理 l

体内获能——交配母畜的子宫内冲取

精子 l体外获能

精子体外获能方法 l血清白蛋白溶液共孵育 l高离子强度溶液处理(HIS) l钙离子载体 l氨基多糖 l添加黄嘌呤类诱导物（咖啡因、茶碱等） l血小板激活因子卵母细胞的体外受精

1.常规体外受精技术——获能精子与卵子共培养

2.与分离精子相结合的体外受精技术

3.显微受精技术——透明带下注射卵细胞质内单精子显微注射

受精卵的体外发育-1受精卵的体外发育-2受精卵的体外发育-3受精卵的体外发育-阻滞 l牛胚胎在发育到8～16细胞时存在“阻滞” l小鼠2细胞、大鼠2细胞、猪4细胞、绵羊8～16细胞 l有趣的是胚胎在体外发育出现阻滞的时期,对应于体内是在生殖道里体外发育阻滞阶段的存在表明 l 8～16细胞的发育阶段需要有输卵管提供的特殊的环境条件 l含有早期胚胎发育的因素或条件的是输卵管而不是培养液如何克服受精卵的体外发育阻滞 l回到体内培养环境(移植到受体输卵管) l饲养层共培养，刺激胚胎的发育用于饲养层的细胞有–来源于繁殖器官的细胞–来源于非繁殖组织的细胞–滋养层细胞配子和胚胎的冷冻保存 l原理–利用冷冻保护剂将胚胎保存在超低温环境中(通常是- 196℃的液氮中)–低温能够抑制胚胎细胞的生化活动,降低新陈代谢而保存胚胎，当需要时再将胚胎解冻,复温到正常温度后进行移植低温损伤的两因素理论 l

1972年Mazur¡ª¡ª细胞或胚胎低温损伤的两因素理论，即溶液效应而造成的化学损伤和细胞内结冰而造成的物理损伤。由于冷却速度过慢，胞外溶液中水分大量结冰，溶液浓度提高，胞内水分大量渗出，导致细胞的强烈收缩和细胞处于高浓度的溶液中时间过长，从而造成化学损伤。 l由于冷却速度过快，胞内水分来不及通过细胞膜向外渗出，胞内溶液过冷而结冰，从而造成物理损伤。同样，在复温（解冷）过程中，如果复温速率不当也可能引起细胞内结冰（重结冰）而损伤 l此外，抗冻保护剂的加入或去除不当，则会引起细胞渗透压的明显变化；细胞内外电解质浓度的改变等而造成细胞或胚胎损伤冷冻保存的关键

减少细胞内冰晶对胚胎造成的损伤

保存措施 l

保存液中加入一定浓度的保护剂。

（1）细胞内液保护剂：低分子量可渗物质，如甘油、DMSO、乙二醇等

（2）细胞外液保护剂：低分子量不可渗物质，如半乳糖，蔗糖等通常用pH7.2-7.4的PBS配制。

冷冻保护剂作用 l

能使细胞充分脱水 l

解冻时则以较快的速率升温，使胚胎瞬间通过危险温区（-50～0℃），然后脱除对胚胎细胞有一定伤害作用的冷冻保护剂，使胚胎存活。

低温冻贮的影响•

降低新陈代谢•影响细胞主动离子转运和细胞容积调节•冷休克冷冻方法慢速冷冻（程序冷冻）快速冷冻（玻璃化法）超快速冷冻法胚胎冷冻方法(embryo cryopreservation) l常规冷冻 l一步冷冻法 l玻璃化冷冻法常规冷冻 n将胚胎依次放入含0.7mol/L甘油+PBS和含1.4mol/L甘油+PBS液中，各平衡7~10min; n将平衡后的胚胎装入0.25ml细管放入预先冷却至-7℃的冷冻液，中间段为含胚胎的冷冻液，每段之间用气泡隔开； n将细胞放入预先冷却至-7℃的冷冻仪中，平衡10min后，用液氮中预冷过的医用镊子植冰； n以0.3℃/min的速度，降温至-35℃; n将细管投入液氮； n解冻时从液氮中取出细管，在空气中平衡10-20s，投入35℃水浴中，至冰晶融解后取出； n推出冷冻液及胚胎，将检出的胚胎移入含1.0mol/L蔗糖的PBS中10min，一步脱除冷冻保护剂，再用PBS洗涤胚胎2-3次，用于移植。一步冷冻法也叫一步细管法。该方法是由常规冷冻法改进而来，细管内的冷冻液和蔗糖液是分开的因此，在细管内用蔗糖液可一步脱除甘油抗冻剂，从而利于在生产中推广应用所有溶液在低温时变粘稠，不发生结晶即可固化，形成一种特殊的¡°玻璃化¡±状态，从而使胚胎在急剧的降温过程中得以存活。胚胎冷冻保存技术的应用应用范围广泛，且在某些领域也是必需的（如人体移植器官的保存），在实验动物领域的应用，主要有以下4个方面: 1.应用于实验动物的保护和珍稀、濒危动物种质保存实验动物品种品系的维持，需要一定的场所、设备和大量的物力、财力、人力的投入，并且又不可能完全避免在长期保种繁殖过程中发生基因丢失或漂移。采用胚胎冷冻保存技术，既能把数以千计的实验动物品系保存下来，又能保持它们的遗传品质不便，还可以大大降低保种成本。⒉应用于实验动物的长途运输动物的运输受气候、运输条件等一系列因素的影响。采用胚胎冷冻技术，可以在世界范围内将运输实验动物改为运输实验动物胚胎，从而快速、廉价、便利地实现实验动物资源共享。⒊应用于实验动物的生物净化被病原体感染的实验动物的生物净化，传统上一般采用子宫切开术，取出胎仔由无菌动物或SPF动物代乳。但是这种方法成功率并不高，而且较为麻烦。对于为数甚少的珍贵实验动物（如转基因动物、自然突变动物）按传统方法实行生物净化技术很难达到目的，因为不可能有成批怀孕母鼠用于剖宫取胎。通过胚胎冷冻、胚胎移植等技术，可以使生物净化变得更简便和安全⒋应用于实验动物育种和野生动物的实验动物化胚胎克隆技术、体细胞克隆技术结合胚胎冷冻技术，已经应用于实验动物和其他动物的育种。优点很明显，可以缩短育种时间，可以克服野生动物进入实验室后因环境改变而交配困难，可以利用极少量的原种繁殖出大量的后代，可以克服杂交障碍而实现基因的种间转移（如转基因动物等）胚胎的辅助孵化

Assisted hatching l胚胎冻融可使部分卵裂球衰亡,透明带硬化、破裂而影响胚胎的孵化和着床 l应用显微操作技术,在胚胎移植前,将透明带打孔或使其变薄,使胚胎发育至囊胚阶段,容易脱出透明带与子宫内膜融合辅助孵化方法 l酶消化法 l激光打孔法 l机械切除法 l酸化法 l辅助孵化并不是对所有的患者和所有的胚胎都有提高植入率的作用 l仅是对于那些因某种原因导致自身孵化困难的胚胎有帮助–透明带过厚的胚胎–透明带异常的胚胎胚胎分割 l指用人工方法将植入前胚胎（2细胞～囊胚期）分割成两个或多个部分，分割后的每个部分在适宜的条件下可分别发育 l如移植给适当母体，可得到两个或多个基因型和表型一致的后代 l这一技术已在绵羊、牛、小鼠、大鼠、马、猪等哺乳动物中广为应用胚胎分割的基本原理通过对胚胎的显微外科操作，把一个胚胎分割成两个或多个，由于胚胎发育早期，每个卵裂球都具有发育成一个完整个体的潜在可能性，因此通过胚胎分割技术，可以人工制造同卵双胎或多胎，可成倍地增加胚胎数和产犊数胚胎分割应用 l动物超数排卵与胚胎移植 l克隆动物 l干细胞 l试管婴儿 l转基因动物与动物反应器胚胎移植（embryo transfer)胚胎移植的目的供体超排与配种受体同期发情处理胚胎的采集胚胎的检查移植胚胎胚胎移植 l胚胎移植（embryo transfer)也称受精卵移植，是指一头母畜（称为¡°供体¡±）发情排卵并经过配种后，在一定时间内从其生殖道（输卵管或子宫角）取出受精卵或胚胎，然后把它们移植到另外一头与供体同时发情排卵、但未经配种的母畜（称为¡°受体¡±）的输卵管或子宫角。这个来自供体的胚胎能够在受体的子宫着床，并继续生长和发育，最后产下供体的后代。 l¡°借劣质动物之腹怀优秀个体之胎¡±胚胎移植

成功的羊胚胎移植的目的 n发挥优良母畜的繁殖潜力 n促进家畜改良的速度 n作为胚胎操作的基础 n长期保存冷冻胚胎，便于运输和保存遗传资源胚胎移植过程体外受精（IVF）与胚胎移植（ET）胚胎融合 l胚胎融合的意义 l胚胎融合方法 l嵌合体的鉴定胚胎融合又称嵌合体制作，就是将两个不同品种或不同种除去透明带胚(裸胚)粘合在一起，或者各自一分为二，然后各取一半，融合成新的胚胎，移植给受体，产生具有杂交优势的新后代——嵌合体胚胎融合的意义 l为动物胚胎发育及遗传控制等研究提供了有效手段 l嵌合体后代可集不同品种或不同种动物的不同基因于一体，完全有可能把母代动物的优良遗传性能集中表现出来，从而形成具有高度杂种优势的杂合体。 l嵌合体母畜与公畜交配后，能产生具有正常繁殖力的后代。所以胚胎融合不仅可成倍缩短家畜改良时间，而且也为创造新型的家畜品种提供新的技术手段胚胎融合方法 1．石蜡油挤压法 2．内细胞团囊胚注入法

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