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冷冻胚胎是保存生育功能的唯一成熟方法。冷冻胚胎的技术是将通过试管培育技术得到的胚胎,存置于零下196℃的液氮环境中,得到长时间保存。如果这个周期治疗失败,可以在以后的自然周期中解冻这些胚胎并进行移植。
将胚胎和冷冻液装入冷冻管中,
经过慢速(第2-3天的胚胎)和快速(第5-6天的囊胚)两种降温方式使胚胎能静止下来并可在196度的液氮中保存的一种方法。若有剩余的质量较好的胚胎,可以冷冻保存,待以后自然周期或人工周期解冻后植入子宫腔内,将增加受孕的机会。
可用于一个超排卵周期得到的胚胎数量多,质量好,不能一次全部移植,可将多余的冷冻胚胎保存,以及发生严重卵巢过度刺激综合证的患者,不宜在治疗周期移植胚胎者,可将冷冻胚胎,待以后的自然周期或人工周期进行胚胎复苏移植。冷冻胚胎复苏临床妊娠率为48.28%,囊胚冷冻复苏临床妊娠率为63.48%。
液氮能立即杀死细胞是超低温下,细胞内水分结晶从而造成细胞失水或结构破坏导致细胞死亡。胚胎冷冻保存技术当然不是把胚胎直接放到液氮中,必须经过冷冻保护剂等药剂的处理,让其在降温的过程中不会出现结晶破坏细胞。
细胞内的水分必须用能防冻的化学药品(生物学上称为防冻剂或冷冻保护剂)来取代,不让细胞周围和细胞内部在冷冻过程中形成冰块。如果细胞内的水分在冷却前溢出,冷冻时,细胞的周围和内部就不会产生冰晶,细胞就不会被损伤。
等到细胞内的水分完全被冷冻保护剂取代以后,把胚胎装入细小的麦管或小容器,然后在计算机的控制下,将其温度从室温逐渐降到零下35~40℃左右,然后将装有胚胎的麦管直接放到零下196℃的液氮罐中长期保存。
扩展资料:
工业用途:
工业生产中,用压缩液体空气分馏的方法获得液氮,可以用于作为深度制冷剂,由于其化学惰性,可以直接和生物组织接触,立即冷冻而不会破坏生物活性,因此可以用于:
1、迅速冷冻和运输食品,或制作冰品;
2、进行低温物理学的研究;
3、在科学教育中演示低温状态。在常温下柔软的物体在液氮中浸泡一下,就会脆如玻璃;
4、提供高温超导体显示超导性所需的温度,例如钇钡铜氧;
5、可作制冷剂,用来迅速冷冻生物组织,防止组织被破坏;
6、用于工业制氮肥。
三步平衡法
(1)10%甘油保存液的配制
取9毫升20%羊血清的PBS,加入1毫升甘油,用吸管反复混合15~20次,经0.22微米滤器过滤到灭菌器内待用。
(2)取含20%羊血清0.3摩尔蔗糖的PBS 2毫升和3.5毫升,分别加入10%甘油3毫升和1.5毫升,配成含6%和3%甘油的蔗糖冷冻液。将3%、6%和10%三种甘油浓度的冷冻液分别装入小培养皿。
(3)胚胎分别在3%、6%和10%甘油的冷冻液中浸5分钟。
(4)胚胎装管
用0.25毫升塑料细管按以下顺序吸入,少量的10%甘油的PBS液、气泡、10%甘油的PBS液(含有胚胎)、气泡、少量的10%甘油的PBS液,加热封口两道(图9-18)。
图9-18胚胎装管示意图
(5)塑料细管的编号
剪一段(2厘米)0.5毫升塑料细管作为标记外套,内装色纸,注明供体品种、耳号、胚胎发育阶段及等级、制作日期(年、月、日),并在外套管上写明序号备查。
(6)冷冻程序
将细管直接浸入冷冻仪的酒精浴槽内,以1℃/分钟的速度从室温降至-6℃,停5分钟后植冰,再停留10分钟,以0.3℃/分钟的速度降至-36℃,再以0.1℃/分钟的速度降至-38℃,直接投入液氮,长期保存。
(7)冷冻胚胎的解冻
①解冻液的配制根据上文所述配制出10%、6%和3%甘油的蔗糖解冻液,用0.22微米过滤器灭菌,分装在小培养皿内,第1~4杯分别为10%、6%、3%、0%甘油的蔗糖解冻液,第5杯为PBS保存液。
②胚胎的解冻胚胎从液氮中取出,在3秒钟内投入38℃水浴,浸10秒钟。
③三步脱甘油用70%酒精棉球擦拭塑料细管和剪刀刃,剪去棉塞端,与带有空气的1毫升注射器连接。再剪去细管的另一端,在室温下将胚胎推入10%甘油和0.3摩尔蔗糖的PBS解冻液中,放置5分钟后依次移入6%、3%和0%甘油的蔗糖PBS解冻液中,各停留5分钟,最后移至PBS保存液中镜检待用。
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