试述胚胎冷冻保存的步骤 胚胎冷冻一年费用多少

这篇文章给大家聊聊关于试述胚胎冷冻保存的步骤，以及胚胎冷冻一年费用多少对应的知识点，希望对各位有所帮助，如果您有相关问题想要咨询，可以和我们的在线顾问联系。

胚胎如何冷冻保存

三步平衡法

（1）10%甘油保存液的配制

取9毫升20%羊血清的PBS，加入1毫升甘油，用吸管反复混合15～20次，经0.22微米滤器过滤到灭菌器内待用。

（2）取含20%羊血清0.3摩尔蔗糖的PBS 2毫升和3.5毫升，分别加入10%甘油3毫升和1.5毫升，配成含6%和3%甘油的蔗糖冷冻液。将3%、6%和10%三种甘油浓度的冷冻液分别装入小培养皿。

（3）胚胎分别在3%、6%和10%甘油的冷冻液中浸5分钟。

（4）胚胎装管

用0.25毫升塑料细管按以下顺序吸入，少量的10%甘油的PBS液、气泡、10%甘油的PBS液（含有胚胎）、气泡、少量的10%甘油的PBS液，加热封口两道（图9-18）。

图9-18胚胎装管示意图

（5）塑料细管的编号

剪一段（2厘米）0.5毫升塑料细管作为标记外套，内装色纸，注明供体品种、耳号、胚胎发育阶段及等级、制作日期（年、月、日），并在外套管上写明序号备查。

（6）冷冻程序

将细管直接浸入冷冻仪的酒精浴槽内，以1℃/分钟的速度从室温降至-6℃，停5分钟后植冰，再停留10分钟，以0.3℃/分钟的速度降至-36℃，再以0.1℃/分钟的速度降至-38℃，直接投入液氮，长期保存。

（7）冷冻胚胎的解冻

①解冻液的配制根据上文所述配制出10%、6%和3%甘油的蔗糖解冻液，用0.22微米过滤器灭菌，分装在小培养皿内，第1～4杯分别为10%、6%、3%、0%甘油的蔗糖解冻液，第5杯为PBS保存液。

②胚胎的解冻胚胎从液氮中取出，在3秒钟内投入38℃水浴，浸10秒钟。

③三步脱甘油用70%酒精棉球擦拭塑料细管和剪刀刃，剪去棉塞端，与带有空气的1毫升注射器连接。再剪去细管的另一端，在室温下将胚胎推入10%甘油和0.3摩尔蔗糖的PBS解冻液中，放置5分钟后依次移入6%、3%和0%甘油的蔗糖PBS解冻液中，各停留5分钟，最后移至PBS保存液中镜检待用。

胚胎冷冻保存的方法有哪些他们的异同点是什么

在丁香园（ http://dxy.ac.cn）找到：

关键词：胚胎冷冻；转基因小鼠；胚胎移植

随着生物工程技术的发展．出现了许多生物工程小鼠品系．促使胚胎冷冻技术得到了广泛应用。胚胎冷冻技术不仅为转基因动物提供可用胚胎．还使胚胎移植不受时间、地域限制。简化引种过程．防止疾病传播。为建立优良动物的胚胎库提供了条件。综述了几种常用的胚胎冷冻方法及其在转基因小鼠中的应用研究．指出了胚胎冷冻方法存在的主要问题，并展望了其发展

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2008-5-1 21:41

胚胎冷冻技术是一种简单、实用、经济而可靠的保种方法，它能降低动物饲养和繁育成本，扩大动物品系的保存能力，也可随时为其它胚胎工程技术如胚胎移植、胚胎分割、体外受精、动物性别控制、转基因动物技术和胚胎干细胞技术等提供可用胚胎。通过建立胚胎库，可以在世界范围内运送胚胎，从而取代活体运输，既降低了费用又可避免疾病的传播，还能解决遗传漂变以及人为、环境因素造成的动物生物学特征和遗传特性的改变等问题。

1胚胎冷冻技术

胚胎冷冻技术是对体内或体外受精所得到的可供移植的胚胎进行冷冻，并根据需要解冻后供移植的一种生物技术。胚胎冷冻技术的发展经历了由繁到简的过程，主要围绕程序简化、缩短冻存时间、选择低温保护剂及冷冻方法、解冻方法等方面进行研究，所选方法和程序的目的都是尽可能减少胚胎在冷冻时的物理损伤，提高胚胎冷冻／解冻后的存活率和移植妊娠率，并产下健康的后代。

1．1冷冻方法

(1)程序冷冻法

程序冷冻法主要使用渗透较慢的低温保护剂，如乙二醇(EG)、丙二醇(PG)、甘油(G)、二甲基亚砜(DMSO)，使冷冻保护剂充分渗透人胚胎细胞内，平衡后，利用程序降温仪缓慢降温，最后投入液氮保存。1972年，Whittingham等首次报导了小鼠胚胎在-196℃和-269℃冷冻保存获得成功，引起了科学界的广泛重视。随后相继应用这种方法在牛、兔、绵羊、大鼠、山羊和马等多种哺乳动物上获得成功。

程序冷冻法采用较低浓度的冷冻保护剂，对胚胎毒性损害小，解冻后存活率较高。但因其操作繁琐，降温速度慢，致使所需时间长，需要特殊的降温装置，在不具备实验条件的场所不能使用此法进行胚胎冷冻。目前国内外均较少使用。

(2)玻璃化冷冻法

玻璃化冷冻法是将胚胎或卵母细胞在适当的冷冻保护剂混合液中做短暂处理后，直接投入液氮。与传统的程序冷冻法相比，玻璃化冷冻法的优点主要在于：细胞和液氮直接接触，冷冻速率明显增加；方法简单，缩短了冷冻程序的时间；免除了昂贵的程序降温仪的费用，在一般的实验室就可进行操作。下面介绍几种常用的玻璃化冷冻法。

①超快速冷冻法

l985年，Rail等首次应用DMSO、乙酰胺、丙二醇、聚乙二醇组成的玻璃化溶液超快速冷冻小鼠胚胎获得成功。1986年，Scheffen等以25%甘油和25% 1，2一丙二醇玻璃化超快速冷冻牛胚胎，降低了玻璃化溶液的毒性；同年，Kasai等以40%乙二醇、0．5 mol／L蔗糖和30 Ficoll的混合溶液超快速冷冻小鼠胚胎。获得了较高存活率(98%)，进一步降低了玻璃化溶液的毒性；2002年，朱士恩等应用以EG和DMSO为主体的抗冻保护剂玻璃化冷冻小鼠原核胚，移植后妊娠率和产仔率与鲜胚的效果相近。2003年，Fujio等以DAP213(2．0 mol／LDMSO+1．0 mol／l乙酰胺+3．0 mol／L丙二醇)为冷冻保护剂冷冻小鼠获得成功；2005年，Baranyai等分别用SSV(Solid surface vitrification)法和麦管法冷冻小鼠8一细胞期胚胎，证明了SSV法对于桑椹胚和胚泡阶段的胚胎是一种较好的冷冻方法。

②开放式拉长塑料细管法(open pulled straws，OPS)

OPS法是丹麦人Vajta于1997年发明的，他使用薄壁细管，利用毛细现象将微量冷冻液滴和胚胎一起吸人管内后，投入液氮。这种方法克服了传统玻璃化的缺点，加快了冷冻速度和复苏速度，其降温速率可达2 500℃／min，且对细胞的毒性和损伤作用较小。1998年，Vajta等应用OPS法冷冻牛不同阶段的胚胎，结果表明，受精后3～7 d的胚胎复苏后囊胚形成率为60～95%，和新鲜胚胎无显著差别，且牛卵母细胞复苏后囊胚形成率高达25%，移植后产生3个仔牛。Lazar等应用OPS玻璃化法冷冻了117个牛囊胎，复苏后孵化率为39．5%，移植率和妊娠率分别为16．7%和50%，均显著高于普通麦管玻璃化冷冻。朱亮等应用OPS法和传统麦管法对小鼠扩张囊胚进行玻璃化冷冻，结果表明，应用OPS法冷冻小鼠囊胚存活率(82．3%)显著高于应用传统麦管者(68．6％)，且前者的冷冻囊胚孵出率(70．3%)也明显高于后者(57．1%)，因此认为OPS法是一种行之有效的冷冻方法。但是OPS法也存在一些不足，由于冷冻液与液氮直接接触，液氮里的一些潜在的污染源会增加污染的机会。

③封闭式拉长塑料细管法(closed pulled straws，CPS)

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有图，拷不下，可能有新回复：http://dxy.ac.cn/wiki/thread-664-1-1.html

试管婴儿的基本步骤

试管婴儿的步骤因患者的具体情况而有一些差异。它可以是简单的体外受精和胚胎移植，也可能是体外受精加上其他的辅助生殖技术，如显微授精、辅助孵化、外科方法取精、卵子的体外成熟、卵子/精子/胚胎冷冻、胚胎着床前诊断等。先介绍简单的体外受精和胚胎移植技术，它是试管婴儿技术的基础。

试管婴儿的基本步骤是：让女性产生数个卵子，将卵子从卵巢内取出，精子从男性取出，在试管婴儿实验室里使精子和卵子受精，受精后的卵子体外培养以便选择好的胚胎用来移植，将胚胎移植到患者的子宫，胚胎移植后的妊娠支持，胚胎移植后的妊娠检查，妊娠后的胎儿数日检查及胚胎着床部位的确定等。

1．女性患者的卵子产生

女性患者的卵子产生在临床上叫做控制性超排卵处理，需要10～15天的时间。

什么是超排卵处理？为何要进行超排卵处理呢？

下文从自然排卵谈起。妇女的自然排卵周期中一般只有1个（有时也有1个以上）的优势卵泡发育，这个优势卵泡内的卵子成熟、排卵，受精后只能形成1个胚胎（单胎）。如果有两个卵成熟、排卵，受精后就会形成两个胚胎（异卵双胞胎）。如果有1个卵成熟、排卵，受精后形成1个胚胎，但这个胚胎在着床前分裂成两部分，也会形成两个胚胎（同卵双胞胎）。

由此可见，一般自然排卵也就是1个。而用这1个卵来进行体外受精的话，最多只能生产1个胚胎。在胚胎移植时就没有选择的余地。移植1个胚胎的妊娠率是很低的。有时，这个卵可能不被受精或不发育，就没有机会怀孕。所以需要采用控制性超排卵来增强与改善卵巢功能，以达到不受自然周期的限制，获得多个健康卵子的目的，这样在实验室里可以培养出更多的胚胎，从中选择高质量的胚胎移植，就能增加怀孕的机会。

控制性超排卵一般是先用一种叫GnRHA（促性腺激素释放激素激动剂，具体是达菲林和达必佳）的激素药物，它能阻止体内促卵泡激素和促黄体激素的分泌，这样外源性的激素就更能发挥作用。再用卵泡生长的激素刺激卵巢中的卵泡成长。为了使卵巢内的多个卵泡同时发育，一般患者是在月经期的第2－3天开始用促卵泡激素，这时的卵巢内一般没有大的卵泡。

依据患者对药物的反应调整药物使用剂量和使用时间，患者的年龄和对药物的反应不同，用药的剂量和用药时间也不同。待卵泡长到一定程度，卵泡内的卵子长到能够成熟的大小，再给予促卵子成熟的激素。等卵子基木成熟，但还没有排卵之前，通过手术方法把它们取出来。

对于大多数患者，需持续用药10天左右，有些可能短到8天，而长者可达15~16天。药物的种类和剂量取决于病人的'具体情况（细节请读排卵药物和排卵处理章节）。

在一些治疗周期中，应用药物后排卵可能会自动发生。当自动排卵发生时，卵子可能在盆腔中丢失，这个周期为此必须取消。有些患者可能在用药几天后，卵巢仍然没有反应，即无任何卵泡生长．对于这种情况，医生也会取消这一治疗周期。

2．卵子诱导成熟（取卵前35～36小时）

上述用药大多数情况下只能使卵子长大，但是还不能获得成熟卵。为了评价卵泡内的卵子是否具有成熟能力，医生必须用超声仪来监测卵泡的大小，并配合检查血液的雌激素水平。当2或3个以上的卵泡直径大于1。8～2厘米，雌激素水平与卵泡数量相符时，这时的卵子就具有成熟的能力了。医生便可注射人绒毛促性腺激素促使卵泡内卵子成熟。人卵子的成熟时间大约是36-40小时，注射人绒毛促性腺激素后必须在35~36小时内取出。因此，医生会安排患者的取卵时间。由于取卵手术一般是在上午进行，所以注射人绒毛促性腺激素的时间一般在前两天的下午到晚上进行。

3．取卵（胚胎的第0天）

取卵是在注射了人绒毛促性腺激素的35～36小时内进行。过早或过迟取卵都会影响卵的取出率和取出卵的质量。过早可能会使卵子未能完全成熟，有较多的未成熟卵，而过迟有可能使一些大卵泡排卵，因而取不到卵。

取卵是一个小手术，可以是在全身麻醉下或是在局部麻巢下进行。经阴道超声仪引导，将取卵针穿过阴道，直达卵巢吸取卵子后，实验室人员立即在显微镜下将吸到的卵子移到含有胚胎培养液的培养皿中，置于37℃的培养箱中培养。由于阴道内超声波吸入术是一种小手术，有些医生为了让患者节约费用只使用止痛药而不使用全身麻醉。

一般取卵时间在30分钟之内。患者取卵后只有轻微的疼痛和极少量的出血，休息1~2个小时就可以回家，不会影响日常工作和生活。由于卵泡大小不一，因此取出的卵子的成熟阶段并不完全一致。有的可能是未成熟的，而有的可能是过成熟的。刚取出的卵周围被卵丘细胞所包围，一般可以通过这些细胞的扩张程度判断出卵子的成熟情况。但是，要知道它们的准确成熟阶段，必须将这些细胞与卵子分开。一般说来，可发现有以下几种卵子：

1）成熟卵透明带下的卵周隙内有一个小的细胞，叫做第一极体，它是由卵子释放的。第一极体的释放是卵子成熟的指标。

2）未成熟卵有两种不同时期的未成熟卵。一种是在透明带下的卵周隙内没有第一极体，但卵子内有一个明显的核，叫做生发泡，这种卵叫做生发泡期卵，这是最早期的未成熟卵。另一种是卵子的卵周隙内没有第一极体，卵子内也没有一个明显的核，这是处于生发泡期卵和成熟卵之间的未成熟卵。未成熟卵是不能用于受精的，必须等到它们完全成熟后才能用来受精。

3）过成熟卵卵子成熟后必须受精。从卵子成熟到受精之间的时间一般是5～6个小时。如果在这个时间段内未能受精，卵子将会开始老化，最后死亡。由于卵子取出的时候卵泡大小不一，卵子的成熟阶段也就不可能在同一个时期。如果用时间过长，或卵子在受精前的体外时间过长都会使卵子过成熟。虽然过成熟卵能够被受精，但是由它产生的胚胎质量将会很差，胚胎移植后很难怀孕。

4）异常卵有些卵从体积上看要比正常卵大许多，卵周隙内有两个第一极体，这样的卵的染色体是异常的，通常有两套染色体，因此是不能用来受精的。有的卵可能在成熟的某一阶段细胞内有异常的形态，如空泡、质地变黑等，这些都是卵子质量不好的标志。

4．取精（胚胎的第0天）

用于体外受精的精子可以是新鲜采集的jing液，也可以是冷冻保存的jing液或者是从睾丸、附睾内抽取的精子。

如果是新鲜jing液，采集应与取卵同时进行。实验室工作人员或护士会告诉病人注意事项和采集方法，并提供无菌的jing液采集小杯。jing液采集后，需马上送到实验室，实验室工作人员接照实验室方法处理jing液，包括将液化的jing液在加入洗涤液后离心，将精浆除去，再用上游法或密度梯度离心法将活动的精子分离出来。

如果是睾丸或附睾内抽取精子，丈夫需要做一个小手术来取得精子。如果是冷冻精子或供精（大多数是冷冻精子），精子应该在取卵前储藏在实验室，不需男性患者当天去门诊。

5．授精（胚胎的第0天）

授精本身是一个非常简单的过程。如果要做常规的体外受精，取卵后4~5小时将处理后的精子在计算确定好数量后与卵子放在同一个培养皿中，共同培养14~18小时左右，然后在显微镜下观察受精情况。精子数量必须确定，精子过多或过少都会影响卵子受精的结果。精子过多将导致多精子受精卵的产生，而精子过少将不能使卵子受精。若精子质量太差，就无法做常规的体外受精，如睾丸、附睾内抽取的精子，则必须以显微注射的方法授精（详见显微授精）。

6．受精检查（胚胎的第1天）受精14－18小时后，必须检查卵子的受精情况。将那些受精的卵子（这时候应该叫受精卵）挑选出来在胚胎培养液中继续培养。用来受精的卵子并不一定会全部成功受精，有的可能没有受精，而有的可能是异常受精。受精卵的判断有以下几个标准：

1）未受精卵精子没有进入卵子，卵子的状态与受精前完全一样。这些卵子可能会出现一些过成熟的表现，有时很难从卵子的形态上来判断。如果重新授精，这些卵子也有受精的可能，但来源于这种卵的受精卵，胚胎的发育不是很好，如果移植这样的胚胎怀孕的机会是非常小的。

2）正常受精卵一个精子穿入卵子，并将卵子激活，卵子释放出第二极体。因而卵周隙内可以看到两个极体，卵子的分裂到此为止。卵子内这时形成两个核，称为原核，其中一个来源于卵子（雌原核），而另一个来源于精子（雄原核）。这是正常受精卵，不过这时候应当称之为胚胎。受精卵内的遗传物有一半来自卵子，另一半来自精子。准确地讲，一个真正的生命就此开始了。

3）多精受精卵如果有两个或者两个以上的精子进入卵子，卵子也能够被激活，并释放出第二极体，并形成一个来自于卵子的原核，但是每一个进入卵子的精子也能形成一个来自于精子的原核。因此，这时候的卵子内部有三个或三个以上的核。这种受精卵叫做多精受精卵。胚胎的染色体将来就不是 23对，而是多于23对。大多数情况下多精受精卵不能正常发育和着床。多精受精卵的胚胎必须废弃，不能用来移植。

多精受精卵出现有两个方面的原因：一个是卵子方面。在正常情况下，卵子成熟后．它会产生一种多精受精阻止机制，它包括卵子的膜下出现的一些含有酶的颗粒（叫做皮质颗粒）和卵子周围的透明带。当第一个精子进入卵子的时候，这些皮质颗粒的膜与卵细胞膜融合．将酶释放到卵周隙。细胞膜的变化快速地阻止了正在进入的其他精子。与此同时，皮质颗粒释放的酶将对透明带的蛋白质起作用，改变透明带的性质，使其他精子不能继续进入透明带，这样一来就达到了阻止多精受精的目的。如果卵子的成熟有问题或透明带异常，都会导致多精受精。这种情况在临床上较为少见，如果有，可以用显微受精的方法来避免。另一个是精子方面。正常受精时，一个卵子的周围不是只有一个精子，而是有数以千计的精子，这样才能保证有一个精子进入。如果卵子周围精子过少，卵子就不能被受精，而精子过多，将会导致多精受精。这时候几个精子同时进入卵子，卵子无法在短时间内阻止它们。多精受精的程度和多精受精的比例与受精时的精子浓度成正比。因此，常规的体外受精时的精子浓度必须计算准确，以减少多精受精。

4）孤雌激活卵孤雌激活卵是指卵子内只有一个来自卵子的原核，而没有来自精子的原核，也就是说只有一个核。它的出现情况比较复杂。可能是精子没有进入，卵子被自发激活，这就是纯粹的孤雌激活。也可能是精子进入了卵子并将卵子激活，但是精子的核没有变成原核。这种卵也有分裂的情况，但胚胎不能着床或发育成胎儿，因此也必须废弃。

受精检查必须在受精后20小时内进行。20小时后，由子两个原核的核膜融合，并将开始胚胎的分裂．就无法判定是否受精。

一般说来，体外受精的正常受精率在70％～90％之间。有的患者的卵子可能全部受精，而有些患者的卵子可能没有一个受精。

7．胚胎体外培养（胚胎的第1～6天）

正常受精卵必须放到提前准备好了的胚胎培养液内培养。培养的当天（第1天），胚胎应该分裂l次，成为2细胞；第2天再分裂l次成为4细胞；到第3天时，好的胚胎应该是分裂了3次的8细胞，有时也会出现4～7细胞或大于8细胞的胚胎。如果这时候不移植胚胎，胚胎必须移到新鲜配制的胚胎培养液里继续培养约48～72小时。这时候，好的胚胎应该分裂了6次以上并形成囊胚。有的囊胚开始孵化或已完全从透明带中孵化出来，特别是第6天的胚胎。而不好的胚胎可能停留在某一阶段，只有囊胚可以用来移植，多余的囊胚可以冷冻保存，其他时期的胚胎可以认为已停止发育，一般情况下丢弃。

8．胚胎移植（胚胎的第3—6天）理论上，胚胎在受精后的第l～6天的任何时期都可以移植。但是，为了选择质量更好的胚胎，大多数试管婴儿中心选择第3－6天胚胎来移植。此时依据患者的年龄，曾经怀孕与否及胚胎的质量，决定移植胚胎的数目。

胚胎移植是一个非常简单的程序，也是一个非常关键的程序，—般不需麻醉。手术时妇女处于仰卧姿势。医生用一个阴道扩张器暴露并清洗子宫颈，去掉子宫颈黏液后，检查子宫颈口的通畅状况。然后，实验室技术人员将挑选好的胚胎吸进一条移植导管，递给医生，医生将移植导管通过子宫颈送入子宫，把含有胚胎的液体注射到子宫腔内。在这个过程中可以移植一个或多个胚胎。整个移植操作仅需几分钟。

移植后息者休息约l个小时即可回家。在移植后的2－4天内尽量休息，因为这是胚胎着床的重要时期。目前大多数医生边使用超声仪观察边进行移植胚胎，这样医生可以准确地掌握胚胎的移植位置，怀孕率也会明显的提高。

9．黄体的支持和妊娠检查（胚胎移植后14天）取卵后的第2～3天，或胚胎移植的前l天（第3天的胚胎移值）或前2－3天（囊胚移植）应该给患者使用孕酮来支持黄体。孕酮可以是口服的、阴道内给予的或是肌肉内注射的。孕酮的服用应持续到怀孕的诊断。如果没有怀孕，即刻停止使用，如果怀孕了则继续使用直到怀孕10周左右。有时黄体的支持还需要在胚胎移植后的几天内给予1或2次的绒毛促性腺激素，以补充体内过低的绒毛促性腺激素水平。

胚胎移植后第14天，胎儿体积仍然很小，无法在超声波仪器下看清，很难判断是否怀孕。但是由于胚胎着床后将分泌大量的绒毛促性腺激素，这些激素会进入血液，并会进入尿液，因此，可通过验尿或验血来确定绒毛促性腺激素的含量，从而判断是否怀孕。怀孕检查可能在14天后重复几次以便确诊。

10．胎儿检查（胚胎移植后4~6周）妊娠4—6周后，胎儿体积在超声波仪器下清晰可见，因此可以通过超声波仪器进一步来判断怀孕情况，并且还可以观察胎儿的数目。超声波仪器下可见胎儿的发育、心脏的跳动和胎儿的活动情况。因此，怀孕后需要定时到产科医生那里做检查直到胎儿分娩。

生产试管婴儿日程表当夫妇决定用试管婴儿的技术治疗不孕时，从用药的第一天到胚胎移植14天后的怀孕检查，对于不孕夫妇来说是一个非常关键的时期。每天的生活和工作必须要配合医生所安排的检查、打针。不论你的工作有多么忙，既然已经决定了要接受试管婴儿的方案，患者就应该以治疗作为此段时间的重点。其实，如果安排好你的日程，既不耽误你的工作，也能保证最好的配合治疗。应当引以为戒的是，也许一个小的失误，会使你的这一治疗周期被取消。因此，细致的安排是相当重要的。

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